Institutul de Cercetari Biologice Iasi

Go to content

Main menu

Etapa IV

Proiecte > CLAVIVET-62065 > Rezultate

Stabilirea parametrilor de cultivare in conditii de micropilot a materialului biologic. Evaluarea microbiologica, biochimica si farmacologica a calitatii materialului biologic conservat, prin testari in vitro si in vivo ale efectului farmacodinamic. Izolarea fractiunii/fractiunilor bioactive, evaluarea farmacologica preclinica in vivo a proprietatii tumorosupresoare si caracterizarea profilului chimic al fractiunilor bioactive/Elaborarea biotehnologiei de obtinere a unor produsi de uz veterinar si caracterizarea complexa a acestora.

  • interesul economic deosebit pentru obţinerea în culturi submerse de Claviceps purpurea a unor produşi activi din punct de vedere biologic a determinat interesul echipei noastre de cercetare pentru studierea unor indicatori care să furnizeze informaţii utile legate de capacitatea fungului de a le produce alcaloizi clavinici în diferite condiţii de cultivare, de extragere si purificare a acestora precum si de evaluare farmacologica preclinica in vivo, pe purtatori de diverse sisteme tumorale experimentale si clinic veterinara pe animale cu tumori spontane, a eficientei oncochimioterapiei experimentale, prin dovedirea existentei relatiei doza –efect, prin comparare cu potentialul terapeutic al unor citostatice standard. Rezultatele etapei anterioare au fost utilizate si cercetarile au fost continuate prin analizarea fractiilor biologic active.

  • rezultatele noastre sugerează că variaţia indicatorilor biochimici studiaţi (conţinut alcaloidic total, procentul alcaloizilor clavinici, conţinut de lipide totale, conţinut de ADN, conţinut de ARN) este dependentă de condiţiile de cultivare (agitare, aerare, temperatura), mediul de cultura utilizat (concentratia si tipul surselor de carbon si azot), de particularităţile fiecărei tulpini şi de vârsta culturilor de Claviceps purpurea. În condiţii micropilot, s-a observat ca tendinţa proceselor de biosinteză alcaloidică şi lipidică este de a se desfăşura în paralel, in conditiile de cultivare stabilite, precum si modificarea drastica a raportului dintre continutul alcaloidic total si cel in alcaloizi clavinici, in functie de sursele de carbon si azot utilizate.

  • extractele  miceliene brute rezultate din procesul de fermentatie, cu activitate antineoplazica dovedita, au fost supuse unui proces de fractionare chimica specifica, utilizand drept solventi cloroformul sau amestecul cloroform – alcool isopropilic (4:1, v/v). Prin cromatografie lichida de inalta performanta - HPLC cu faza inversa in amestec de eter-etanol.(80:20), in regim izocrat, in fractiile active a fost identificat un singur compus – agroclavina.

  • testarea in vitro a proprietăţii citostatice a produsului clavinic, pe culturi de celule neoplazice umane HeLa şi HEp-2p, realizată pe modele experimentale adecvate, a permis (prin metode biochimice şi citometrice) evidenţierea şi dovedirea reproductibilităţii efectului proteinosintezo- şi mitoinhibitor, de inhibare a dezvoltării culturilor celulare la doza citostatic activă, EC50, de 5 µg/ ml, stabilirea dependenţei eficienţei farmacodinamice de doza de tratament – ce permite optimizarea limitată a eficienţei prin manipularea experimentală a dozelor de tratament (ineficientă la doza de 1µg/ ml, eficientă 50% la doza de 5,0 µg/ ml si potenţată la 10,0 µg/ ml, ajungând la peste 90%)– precum şi aprecierea potenţialului citostatic al produsului clavinic prin prisma unor citostatice standard de uz clinic (5-fluorouracil, etopozid, metotrexat si ciclofosfamida), fiind similar celui al 5 FU si superior impactului citostatic al etopozidului si metotrexatului . Evidenţierea şi cuantificarea, prin citometrie în flux continuu, a efectului noului produs clavinic asupra proliferării şi ciclului celular, asupra apoptozei celulare, precum şi asupra viabilităţii celulare, exprimată prin raportul numeric între celulele vii şi moarte, în conditiile folosirii unei game de doze inferioare, egale şi superioare dozei EC 50%, a reconfirmat acţiunea predominant citostatică şi acţiunea citotoxică a agentului bioactiv.

  • in vivo, tratamentul zilnic, intraperitoneal al purtătorilor de tumoră Walker şi respectiv Guérin T- 8 cu produsul clavinic, în doză de 50 µg/kcorp  s-a concretizat prin inducerea unor scăderi, semnificative statistic, ale masei tumorale medii, faţă de greutatea tumorală medie martor, care au permis estimarea unor valori ale indicilor de evaluare (regresie tumorală medie, valoare T/C) a acţiunii antitumorale in vivo semnificative din punct de vedere citostatic (faţă de valorile minime impuse de programele american şi nemţesc de screening preclinic, elaborate în vederea identificării unor noi posibili agenţi antitumorali: GTM de 35% şi valoare T/C de 0,54).

  • la animale de companie, cu tumori externe, greu abordabile chirurgical, produsul a fost testat pe 10 câini cu tumori externe mamare şi rectale cu dimensiuni variabile. S-au aplicat doze saptamanale de 50 µg/kg timp de 10 săptămâni intratumoral în puncte diferite constatându-se reducerea vizibilă în dimensiuni a tumorilor externe în mare măsură şi a metastazelor de asemenea

  • produsul clavinic obtinut este eficient in doza mai mica decât a celorlalte produse utilizate în terapia oncologică veterinară si nu are efecte secundare majore, sau reacţii secundare importante, nefrotoxicitatea şi hepatotoxicitatea fiind aproape nesesizabile, comparativ cu citostaticele utilizate in mod frecvent.

  • produsul utilizat experimental este mai eficient în cazul administrării lui la animale faţă de chimioterapia utilizată în prezent atât datorită nefrotoxicităţii şi hepatotoxicităţii sale mult reduse, cât şi datorită reducerii vizibile a maselor tumorale externe.

 
Back to content | Back to main menu