Institutul de Cercetari Biologice Iasi

Go to content

Main menu

Etapa III

Proiecte > CLAVIVET-62065 > Rezultate

Optimizarea procesului de fermentatie in conditii de micropilot. Fractionarea extractelor bioactive si identificarea componentelor citostatic active prin prescreening-ul in vitro pe diferite tipuri de culturi celulare.

  • obiectivul urmarit si atins in prezenta etapa de studiu este reprezentat de optimizarea procesului de fermentatie in conditii de micropilot, fractionarea extractelor bioactive si identificarea componentelor citostatic active prin prescreening-ul in vitro pe diferite tipuri de culturi celulare.

  • protocolul experimental de cultivare si revigorare a tulpinilor de Claviceps purpurea, in vivo, s-a realizat infectia artificial a plantelor de secara, urmata de colectarea sclerotilor, reizolarea si purificarea tulpinilor, asigurandu-se materialul biologic necesar, cu capacitate biosintetica ridicata.

  • ulterior, au fost stabiliti parametrii de cultivare in conditii de micropilot in fermentatoare de 10 L Sartorius, a tulpinilor selectate. S-a determinat astfel ca aerarea joasa a mediului de cultura stimuleaza atat cresterea ciupercii cat si producerea de alcaloizi, cu un maxim de valori la 6 - 8 zile. Dimpotriva, aerarea puternica a mediului (2,5 vvm), nu a fost favorabila dezvoltarii culturii, dar a stimulat secretia proteica, cu un maxim de productie la 8 zile de fermentatie. De asemenea, nivelul aerarii mediului de cultura modifica raportul dintre continutul alcaloidic din celula, fata de cel excretat in mediu:

  • prin caracterizarea biochimica primara, in dinamica, a materialului biologic de varste diferite s-a determinat momentul optim de obtinere a extractelor potential citostatice. Evaluarea conţinutului total de alcaloizi în miceliul liofilizat al diferitelor tulpini de Claviceps purpurea evidenţiază o capacitate maximă de biosinteză a alcaloizilor ergotici la vârste cuprinse între 8 şi 12 zile, in functie de tulpina analizata. Trecerea la faza de micropilot a evidentiat o comportare biosintetica diferita ciupercii, fata de cea observata la nivel de flacon, in privinta tutoror parametrilor analizati (continut alcaloidic total, proteina totala, continut in acici nucleici, lipide, biomasa umeda, biomasa uscata). Prin analiza pattern-ului electroforetic al proteinelor fungice miceliene şi din lichidul de cultură, în dinamica procesului de biosinteză a alcaloizilor ergolinici, la 9 tulpini diferite de Claviceps purpurea, cultivate în condiţii submerse, prin metoda de separare SDS – PAGE, cu migrarea electroforetică a extractelor proteice miceliene totale (fracţii solubile şi insolubile) obţinute în gel de poliacrilamidă de concentraţie 12%, s-a relevat un profil electroforetic cu 37 benzi proteice comune identificate, cu greutate moleculară cuprinsă între 30 - 220 kDa, dar şi cu mici diferenţe în ceea ce priveşte apariţia a 1-2 benzi proteice, cu greutate moleculară mică, între tulpinile fungice. Spectrul electroforetic al proteinelor, atât cele miceliene cât şi din lichidul de cultură, diferă din punctul de vedere al densităţii benzilor proteice analizate, în cursul procesului de biosinteză, în mod deosebit la nivelul celor cu greutate moleculară mică.

  • un alt obiectiv al studiului a fost stabilirea conditiilor de conservare a materialului biologic, testandu-se metoda liofilizarii si a congelarii la -800C, in scopul conservarii pe termen lung a tulpinilor valoroase de Claviceps purpurea. Rezultatele obtinute confirma superioritatea metodei de conservare prin liofilizare, comparativ cu congelarea materialului biologic.

  • aprofundarea cercetarilor asupra componentelor bioactive din extractul fungal brut s-a realizat prin fracţionarea cu solvenţi de polaritaţi diferite (in funcţie de gradul de hidro/lipofilie). Astfel, au fost separate doua fractiuni, si anume: fractiunea A, constituita in principal din glicoproteine si fractiunea B de natura alcaloidica si derivati fenolici de tip xantone. Fractiile obtinute au fost analizate in privinta activitatii lor citostatice, in vitro, pe culturi de celule HeLa.

  • evaluarea efectului farmacodinamic al biopreparatelor brute obtinute prin testare farmacologica preclinica in vivo, pe animale cu tumori spontane, a confirmat capacitatea lor tumorosupresoare. Pe animale de companie studiul a durat 16 săptămâni constatându-se reducerea în volum a ţesutului tumorizat rectal, reducerea edemului peritumoral şi delimitarea clară a tumorii faţă de ţesutul sănătos. În cazul tumorilor mamare după 7 administrări repetate săptămânal, s-a constatat reducerea în volum a tumorii mamare asupra careia s-a efectuat administrarea, reducerea edemului peritumoral, fluctuenţa tumorii şi delimitarea ei clară faţă de ţesutul sănătos din jur. Cea mai importantă constatare histopatologică este reprezentată de zonele de rarefacţie a ţesutului tumoral apărute prin degenerarea celulelor tumorale şi a stromei tumorale.

 
Back to content | Back to main menu